Badanie krwi na obecność antygenu retrowirusa kociej białaczki (FeLV)

Kolejny z serii postów edukacyjnych, który zawdzięczam Beacie R. Dziękuję!

***

Organizm kota zainfekowanego wirusem wytworzył antygen, czyli białko, które zmusza układ immunologiczny do wytwarzania przeciwciał i równocześnie białko to potrafi łączyć się ze specyficznymi przeciwciałami, specyficznymi – tzn. że nie z dowolnymi. I ta ostatnia cecha jest wykorzystywana do wykrywania antygenu konkretnego wirusa.

Metoda pierwsza – zwykle stosowana jako pierwsza, bo najprostsza:
test immunochromatograficzny (to nie jest ELISA !)

Pasek papieru, zwany membraną, służy do przemieszczania płynnego materiału próbki (do rozpływu krwi wzdłuż niego, zjawisko kapilarne). Wcześniej membrana została nasączona specyficznymi dwoma przeciwciałami (jednym unieruchomionym na powierzchni membrany w miejscu, gdzie może wystąpić kolorowe zabarwienie, oraz drugim ruchomym przeciwciałem oznakowanym złotem). Poszukiwany w próbce krwi antygen potrafi łączyć się z obydwoma przeciwciałami, ale same przeciwciała (bez antygenu) nie połączą się ze sobą. Najpierw antygeny obecne we krwi łączą się z przeciwciałem oznakowanym złotem i płyną w kierunku kreski, gdzie naniesione są te drugie nieruchome przeciwciała. „Ozłocony antygen” przyłącza się do nieruchomych przeciwciał, tworząc kompleks, który ma konkretny kolor (czerwony). Gdyby antygenu nie było, kompleks by nie powstał i nie zaczerwienił. Druga kreska – kontrolna zrobi się czerwona, jak tylko wilgoć próbki dotrze do niej. Mówi to o prawidłowym rozpływie materiału próbki i o prawidłowej jej ilości.

Wady: Wynik jest jakościowy, a nie ilościowy. Wynik fałszywie pozytywny, gdy podobne białko do poszukiwanego antygenu zwiąże się z przeciwciałami, a nie jest antygenem białaczki (około 50 % przypadków). Wynik fałszywie negatywny, gdy wirus jest w fazie latencji (jest, ale ukrywa się i nie prowokuje powstawania antygenów). Wynik jest fałszywie negatywny, gdy z jakichś powodów pato-immunologicznych nie wykształciły się antygeny, choć wirus jest obecny (a tylko antygeny są namierzane, nie wirusy). Wynik jest fałszywie negatywny, gdy stężenie antygenu (mówiące jednak o obecności wirusa) jest za małe, by zobaczyć zakolorowanie (potrzebna czulsza metoda). I wreszcie wynik jest fałszywie negatywny, gdy na skutek statystycznego odchylenia od wzorca (różnorodność natury i jej dewiacji) poszukiwany antygen ma nieco inną specyficzność i ze wzorcowymi przeciwciałami nie zwiąże się, a jest antygenem białaczki (ok. 10 % przypadków fałszywie negatywnych).

źródło procentów: strona 9:
https://www.idexx.com/files/small-animal-health/products-and-services/snap-products/snap-triple/aafp-feline-retrovirus-management-guidelines.pdf


Metoda druga – łatwo dostępna:
ELISA - test immunoenzymosorpcyjny (enzyme-linked immunosorbent assay)

Jest wiele odmian. Ale ogólna zasada jest wspólna. Na podłożu (denko mikroprobówki) jest umieszczone specyficzne przeciwciało, które przywiera do podłoża (nadmiar, który nie przywiera, jest wypłukany). Na podłoże podaje się badaną próbkę. Jeżeli próbka zawierała poszukiwany antygen, to białka te połączą się ze swoimi specyficznymi przeciwciałami na podłożu. Po przepłukaniu mikropróbówki zostają tylko przeciwciała i ich antygeny, o ile były obecne w próbce. Tylko, że tego nie widać gołym okiem. Dlatego dodaje się kolejne przeciwciała, znakowane enzymem, które łączą się z inną częścią antygenu, nie przeszkadzając w poprzednim połączeniu. I kolejne płukanie. Jeżeli antygenu nie było (brak nosicielstwa), nie pozostaną żadne przeciwciała, znakowane enzymem. Jeżeli był, to jest on spułapkowany między warstwą pierwszego specyficznego przeciwciała i drugiego specyficznego przeciwciała. Teraz wystarczy wyzwolić reakcję enzymatyczną (czyli wzmacnianą (!) udziałem enzymów), dającą w efekcie zakolorowanie. Intensywność koloru mierzy się metodami prześwietleniowymi lub odbiciowymi i określa ilościowy wynik (korzystając z krzywej kalibracji uzyskanej dla znanych stężeń). Dzięki wykorzystaniu enzymów uzyskano większą czułość, lepszą wykrywalność małych stężeń, w stosunku do metody immunochromatograficznej i do tego wynik ilościowy, a nie jakościowy. Natomiast wady nie zmieniły się.

Wady: Wynik fałszywie pozytywny, gdy podobne białko do poszukiwanego antygenu zwiąże się z przeciwciałami, a nie jest antygenem białaczki (około 50 % przypadków). Wynik fałszywie negatywny przy latencji wirusa lub gdy na skutek statystycznego odchylenia od wzorca poszukiwany antygen ma nieco inną specyficzność i ze wzorcowymi przeciwciałami nie zwiąże się, a jest antygenem białaczki (ok. 10 % przypadków).

Metoda trzecia – namierza wroga, nie jego ślady:
PCR - Reakcja łańcuchowa polimerazy (polymerase chain reaction)

W warunkach laboratoryjnych, posiadając fragment wzorcowy poszukiwanego DNA (np. fragment DNA konkretnego wirusa), doprowadza się do powielenia DNA w próbce, zgodnych z zadanym fragmentem. W procesie powielania DNA wykorzystuje się polimerazę wyizolowaną z bakterii (takie małe, a tyle potrafi!!!). Jako że powielanie, to wzrost wykładniczy, metoda jest bardzo czuła. Pozwala na wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA. Do tego jest to metoda specyficzna – przy doborze odpowiednich fragmentów wzorcowych, powielaniu ulega tylko jeden odcinek DNA, ten poszukiwany. Metoda potrafi stwierdzić obecność wirusa z bardzo dużą czułością. Nawiasem mówiąc, nagroda Nobla z 1993 roku. Czy metoda ma wady? Retrowirusy szybko mutują, razem ze swoim DNA. Dla najnowszych mocno przekształconych mutacji nie będzie wzorców gotowych do użycia. Czyli wynik może być fałszywie negatywny, choć zdarzyć się może niezwykle rzadko (0,2%). Natomiast wynik pozytywny – to pewność na obecność wirusa.

Nie oczekuję tu żadnych komentarzy, oczywiście. To opracowanie może przyda się komuś, kto znajdzie się w podobnej sytuacji jak ja.